mRNA療法所依賴的體外轉錄mRNA的質量檢測新方法
體外轉錄的信使RNA（IVT mRNA）已被廣泛用于基因功能研究和RNA治療技術。在體外轉錄過程中，會產生雙鏈RNA（dsRNA）副產物。IVT mRNA中的dsRNA副產物會導致強烈的先天免疫反應，甚至導致人體出現休克癥狀，此外，dsRNA副產物也會降低治療性mRNA的翻譯水平，弱化其治療效果。
顯然IVT mRNA在用于RNA療法之前，需要進行嚴格的質量控制。用小鼠和哺乳動物細胞進行質量檢測需要將IVT mRNA進行LNP脂質體包裝，然后再通過尾靜脈注射或者細胞轉染的方式將IVT mRNA導入，檢測干擾素上調的水平。這些方法步驟繁瑣，花費高，時間長，因此目前缺少快速廉價的dsRNA在體檢測方法。
我們研究發現IVT mRNA中的dsRNA污染物會在斑馬魚早期胚胎中引起一種前所未見的應激反應。dsRNA通過PKR-eIF2α非依賴的方式引起全局蛋白質翻譯抑制，并導致p53的激活。在缺乏IFN配體的情況下，p53強烈上調了包括干擾素刺激基因在內的大量基因的表達，如isg15、phlda3、phlda2、casp8和cdkn1a等。其中類泛素蛋白Isg15的大量表達可以通過增強ISGylation來降低蛋白通過泛素蛋白酶體降解的速度。這些發現使我們能夠利用斑馬魚胚胎作為一種廉價、快速和敏感的體內系統來進行IVT mRNA和mRNA疫苗的質量控制。斑馬魚早期胚胎中的p53靶基因，如isg15、phlda3、phlda2、casp8和cdkn1a等的表達水平，可以幫助檢測IVT mRNA中是否存在過多的dsRNA污染物。同時，dsRNA在斑馬魚早期胚胎中對luciferase報告mRNA翻譯的抑制也可以作為檢測標準。
isg15和phlda3表達對雙鏈RNA的敏感性更高
A.經過纖維素層析降低三種IVTmRNA雙鏈RNA的含量，利用J2抗體進行dot blot檢測可以明顯看出纖維素層析后雙鏈RNA的量顯著下降。
B.注射100 pg/胚胎dsRNA污染的cas9 mRNA可以導致phlda3和isg15的大量表達，原位雜交定性檢測可以看到明顯增強的染色信號。
C.qRT-PCR檢測發現p53下游靶基因isg15、phlda3、cdkn1a和casp8都可以用于mRNA中雙鏈RNA副產物的檢測，在減少雙鏈的IVT mRNA的刺激下，這些基因的表達水平明顯下降?？傮w而言，isg15和phlda3的表達對dsRNA的刺激相比于另外兩個基因更加敏感，因此更適用于進行dsRNA污染物的評估。
